【人物与科研】湖北大学李爱涛教授课题组：利用细胞色素P450单加氧酶实现苯的化学和区域选择性合成对苯二酚

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导语

细胞色素P450单加氧酶属于亚铁血红素氧化酶超家族的一员，其含有卟啉铁配基，因此可以催化多种氧化反应，包括未活化碳氢键羟基化、烯烃环氧化、杂原子氧化与还原，并立体和区域选择性地插入单个氧原子进入活化或未活化键。其中来源于巨大芽孢杆菌的自给自足型单一组分P450-BM3酶，不需要额外的电子传递蛋白参与即可实现氧化反应，表现出非常好的应用前景。对苯二酚（HQ）是一种重要的中间体，能用于化学、制药和聚合物工业中许多不同化合物的商业制备。目前HQ通常利用苯作为原料，通过化学法生成，但该过程繁琐且会生成大量副产物丙酮。因此，发展HQ的绿色高效生产方法具有重要意义。经定向进化改造后的P450-BM3酶能催化小分子底物苯高效生成HQ。近日，湖北大学生命科学学院李爱涛课题组联合厦门大学化学化工学院王斌举课题组在该研究领域取得了新突破。相关研究成果发表于Angew. Chem. Int. Ed.（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 764）。该论文通讯作者为湖北大学李爱涛教授和德国马尔堡菲利普大学Manfred T. Reetz教授。

李爱涛教授课题组简介

李爱涛教授课题组依托湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室，成立于2017年9月，目前课题组有教授1名，博士后研究员1名，硕士生6名。课题组主要从事酶的定向进化研究，重点围绕新型P450单加氧酶的挖掘和基于计算机理性设计的P450单加氧酶的分子改造，及其在医药中间体的合成、微生物细胞工厂的构建、高附加值生物产品的合成等方面的应用。

李爱涛教授简介

李爱涛，湖北大学生命科学学院教授，博士生导师，省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室副主任，湖北省“百人计划”入选者。研究方向为蛋白质定向进化和绿色生物转化。2005-2010年就读于华东理工大学生物反应器国家重点实验室并获得博士学位。2011-2017年分别在新加坡国立大学和德国马普煤炭研究所（师从于国际著名分子生物学家和化学家Manfred T. Reetz）担任助理研究员和博士研究员职位。在蛋白质定向进化和绿色生物转化方面有10多年的研究经验。作为项目核心人员负责多项科研课题的具体执行工作，主持国家自然基金项目一项，并取得了重大原创和突破性成果。已发表SCI论文33篇，其中以第一作者或者通讯作者的身份发表SCI论文14篇（其中包括国际顶级刊物Nat. Commun.和Angew. Chem. Int. Ed.以及专业顶级杂志Green Chem., Chem. Commun., Bioresour. Technol.和Appl. Environ. Microb.等），以合作作者在国际顶级杂志J. Am. Chem. Soc.和ACS Catal.等发表多篇论文，总被引用达700余次。撰写外文专著2部，申请专利2项（包括国际专利1项）。

前沿科研成果

利用细胞色素P450单加氧酶实现苯的

化学和区域选择性合成对苯二酚

目前HQ的工业生产通常利用石油衍生的苯作为原料，先经过两个傅-克异丙基化反应，然后在O₂的介导下形成中间体烷基氢过氧化物，最后再通过酸催化形成所需产物HQ，但该方法同时也会产生副产物丙酮，且在酸催化裂解期间，会形成爆炸性丙酮氢过氧化物。由此看出，这种方法不仅步骤繁琐，而且操作安全性差。此外，化学催化合成对苯二酚还可以通过在酸催化剂存在下苯酚与H₂O₂的反应获得，但此反应的产物为对苯二酚和邻苯二酚的混合物。因此，发展HQ绿色高效的生产方法具有重要意义。李爱涛教授课题组利用半合理进化的细胞色素P450-BM3突变体能成功实现苯的化学和区域选择性合成对苯二酚且没有任何过氧化作用。

图1. HQ的合成方法

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

来自于巨大芽孢杆菌的P450-BM3酶是一种自给自足的细胞色素P450单加氧酶，它能催化其天然底物长链脂肪酸的氧化羟基化，但因其底物结合口袋较大，对小分子底物苯基本上是惰性的。李爱涛教授课题组在定向进化细胞色素P450-BM3以缩小其底物结合口袋方面做了一系列创新工作（Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 128, 12205），通过对其活性中心的氨基酸残基进行迭代饱和突变，获得了一系列突变体，其中残基A78、A82和V328突变后活性增强，特别是当引入苯丙氨酸时。因此作者构建了突变体A78F、A82F、V328F、A82F/A328F、V78F/A328F和A82F/A328F/V78F，然后首先使用苯酚作为底物，进行全细胞反应测试突变体的活性，结果单突变体A82F、双突变体A82F/A328F和三重突变体V78F/A82F/A328F表现出较高的转化率，且产物大部分为对苯二酚，仅检测到少量的区域异构体邻苯二酚（图2），没有过氧化作用。进一步，作者对这几种突变体进行纯化操作，并计算苯酚羟基化的转化率和偶联效率，结果同样为如前所述的三种突变体表现较佳。

图2. 含突变体的大肠杆菌细胞对苯酚的活性测定

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接着，作者测试了活性较好的三种突变体（单突变体A82F、双突变体A82F/A328F和三重突变体V78F/A82F/A328F）对苯的活性，结果如图3所示。

图3. 含突变体的大肠杆菌细胞对苯的活性测定

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

P450酶催化芳烃羟基化的机理包括使环氧化物脱芳构化，然后重排成苯酚衍生物。然而，P450酶催化苯酚为什么会生成对苯二酚而不是邻苯二酚呢？为了了解该反应的机制，作者进行了经典的分子动力学模拟和计算，将苯酚对接到具有最高活性的P450-BM3突变体A82F/A328F的活性位点，结果显示由于P450酶的第260位的苏氨酸残基与苯酚中羟基间存在相互作用，迫使苯酚的C3=C4双键最接近P450活性中心Fe=O部分，这表明C3=C4而不是C2=C3，将被选择性地环氧化，然后此环氧化物中间体脱离结合口袋，在水性介质中发生碎裂，最终产生对位羟基化产物HQ。

图4. 计算机模拟实验

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

最后，作者设计了大肠杆菌全细胞，利用最好的P450-BM3突变体A82F/A328F和适当的葡糖基转移酶（来自Rauvolfia serpentina的UDP-葡萄糖依赖性葡糖基转移酶AS），有效地通过一锅法合成了具有抗炎抗菌活性的高附加值产物熊果苷。以苯酚和苯为底物，反应1 h后熊果苷含量可分别达到总物质含量的83%和80%。

图5. （A）一锅法生成熊果苷示意图；（B）以苯为底物生成熊果苷反应进程

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

总之，作者利用半理性蛋白质工程产生的P450-BM3突变体使苯能高效地、区域选择性地产生HQ。经典的分子动力学模拟解析了区域选择的机制。为了说明该催化过程的更大价值，作者设计了大肠杆菌全细胞，利用酶级联反应有效地一锅法合成熊果苷。这些应用研究为微生物细胞工厂的构建提供了新思路，同时期待着更多将廉价底物转化为其它类型高附加值产物的途径的发现。

这一成果近期以封面文章形式发表在国际权威杂志《德国应用化学》上（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 764）。该论文作者为：Hangyu Zhou, Binju Wang, Fei Wang, Xiaojuan Yu, Lixin Ma, Aitao Li, Manfred T. Reetz。

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